RMMG - Revista Médica de Minas Gerais

Volume: 28 e-1984 DOI: http://www.dx.doi.org/10.5935/2238-3182.20180006

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Artigo de Revisao

Recentes avanços no tratamento da anemia falciforme

Recent advances in the sickle cell anemia treatment

Reginaldo Ferreira; Cibele Marli Caçao Paiva Gouvêa

Universidade Federal de Alfenas (UNIFAL-MG)

Endereço para correspondência

Cibele Marli Caçao Paiva Gouvêa
E-mail: cibelegouvea@hotmail.com

Recebido em: 15/12/2016
Aprovado em: 19/06/2018

Instituiçao: Universidade Federal de Alfenas

Resumo

A anemia falciforme é a doença monogênica de maior ocorrência mundial e é causada pela presença de hemoglobina S (HbS), uma variante estrutural decorrente da substituiçao de um aminoácido na cadeia β globina. Essa mutaçao altera as propriedades bioquímicas e fisiológicas da hemoglobina, que tem a tendência de formar agregados fibrilares, no estado desoxigenado, o que produz alteraçoes morfológicas (falcizaçao) e funcionais da hemácia. Assim, todas as manifestaçoes clínicas observadas na doença decorrem da presença da HbS e têm início com a hemólise e a vaso-oclusao, desencadeando os demais eventos da doença, que podem afetar os órgaos e sistemas orgânicos. O tratamento baseia-se no controle dos sintomas. O único medicamento aprovado que altera o curso da doença é o antineoplásico hidroxiureia e, apesar de seu sucesso clínico, nao é curativo e pode desencadear muitos efeitos adversos. O único tratamento curativo é o transplante de células tronco hematopoéticas. A terapia gênica vem sendo estudada há mais de 30 anos e alguns estudos clínicos estao sendo realizados. Novas abordagens moleculares como a ediçao do genoma, uso de RNA terapêutico e manipulaçao genética para induçao da síntese de hemoglobina fetal emergem como possibilidades para a cura da doença.

Palavras-chave: Ediçao do genoma; Hidroxiureia; Terapia gênica, Terapia molecular; RNA terapêutico.

 

INTRODUÇAO

A anemia falciforme é a doença monogênica mais frequente no mundo, caracterizada pela ocorrência de hemácias falcizadas devido à presença da hemoglobina S (HbS), que decorre da mutaçao pontual, uma substituiçao A-T (GAG → GTG) no primeiro éxon do gene β globina, que determina a substituiçao de glutamato por valina na posiçao 6 da cadeia proteica, originando a cadeia variante bS. Assim, a mutaçao de um alelo determina o portador ou traço falcêmico (HbAS; a2βAbS), geralmente, assintomático e a mutaçao nos dois alelos determina a forma clássica da anemia falciforme (HbSS;a2bS2).1 Podem ocorrer ainda, formas heterozigóticas, representadas pelas associaçoes de HbS com outras variantes de hemoglobinas, tais como: HbC, HbD, HbE; as interaçoes com a talassemia e a persistência hereditária da hemoglobina fetal.2,3

A cadeia bS globina, forma um tetrâmero assimétrico, que se polimeriza em baixa pressao parcial de O2, formando longas fibrilas, as quais tornam as hemácias rígidas e modificam sua forma, tornando-as falciformes. A falcizaçao pode ser revertida pelo aumento da pressao parcial de O2, contudo, sucessivas falcizaçoes alteram a estrutura da membrana da hemácia, favorecendo a formaçao da célula, irreversivelmente, falcizada. A HbS pode formar tetrâmeros com a hemoglobina A, normal do adulto (HbA), mas apresenta pouca interaçao com a hemoglobina fetal (HbF). Todas as alteraçoes fisiopatológicas observadas na anemia falciforme devem-se a alteraçao das propriedades bioquímicas da HbS, alterando assim, a morfologia, as propriedades da membrana e vias de sinalizaçao do eritrócito, que levam à anemia hemolítica e vaso-oclusao.4,5

 


Figura 1. Aspectos fisiopatológicos e manifestaçoes clínicas na anemia falciforme. Fonte: do autor.

 

MANIFESTAÇOES CLINICAS

Apesar de causada por distúrbio monogênico, a anemia falciforme apresenta manifestaçoes e severidade clínicas muito variáveis, sendo desde assintomáticas a eventos, potencialmente fatais.6,7

Os sintomas, normalmente, surgem após alguns meses de vida e decorrem da hemólise e vaso-oclusao. As manifestaçoes agudas mais comuns na doença sao: crise vaso-oclusiva, dor, infarto pulmonar, priapismo, surdez, anemia aguda e os indivíduos com anemia falciforme sao mais suscetíveis à infecçao bacteriana e acidente vascular cerebral. As manifestaçoes crônicas incluem anemia, dor e alteraçoes do funcionamento de órgaos vitais, as quais sao observadas, principalmente, em adultos, além das complicaçoes iatrogênicas. Ao longo da vida, o acúmulo de alteraçoes funcionais em vários órgaos agravam as manifestaçoes da doença e reforçam sua fisiopatologia.6,7

Frente à grande variaçao das manifestaçoes clínicas na anemia falciforme, inúmeros estudos genéticos têm sido realizados, contudo, a variabilidade genética nao tem sido suficiente para explicar o espectro fenotípico da doença, como as diferenças na frequência da dor aguda, as complicaçoes crônicas e o índice de mortalidade, uma vez que as mutaçoes gênicas sao limitadas. Dois modificadores genéticos da anemia falciforme estao bem caracterizados, sendo os níveis de HbF e a co-hereditariedade da α-talassemia. Assim, provavelmente os fatores ambientais tenham importante papel na variabilidade fenotípica da doença, contudo, sao ainda pouco estudados.6,7

Como se trata de anemia hemolítica ocorre aumento da bilirrubina indireta, hiperplasia eritróide na medula óssea e elevaçao dos reticulócitos. No entanto, além da hemólise, outros fatores podem contribuir para a gênese da anemia ou agravá-la, tais como: carência de folato, insuficiência renal, crises aplásticas e sequestro esplênico agudo. Em geral a anemia é crônica e devida ao aumento da concentraçao intracelular de 2,3-bisfosfoglicerato, que facilita a liberaçao de O2 nos tecidos e o aumento da forma desóxi da HbS, facilitando sua polimerizaçao. A vaso-oclusao causa episódios de dor intensa, referida como excruciante, tanto em crianças como em adultos. Os episódios dolorosos agudos sao imprevisíveis e, geralmente, severos levando à hospitalizaçao, além disso, ocorre a dor crônica.2,8

 

RECENTES AVANÇOS NO TRATAMENTO DA ANEMIA FALCIFORME

O diagnóstico da anemia falciforme baseia-se na análise da hemoglobina por cromatografia líquida de alta eficiência, eletroforese ou focalizaçao isoelétrica. No Brasil a triagem neonatal para hemoglobinopatias foi introduzida em 2001 e tem sido a principal forma de detecçao precoce da presença de HbSS.8,9

Após décadas de pesquisas sobre a anemia falciforme, muitas informaçoes sobre a mutaçao e fisiopatologia da doença direcionaram o tratamento clínico, contudo, nao há marcadores disponíveis para quantificaçao da ocorrência dos eventos relacionados à anemia falciforme, como a vaso-oclusao, síndrome torácica aguda e danos em órgaos vitais. A ocorrência e melhora da vaso-oclusao têm se baseado apenas nos relatos de dor. Assim, o tratamento da anemia falciforme é complexo e se baseia no tratamento das manifestaçoes clínicas.10 A maioria das medidas terapêuticas na anemia falciforme é de suporte e muda muito pouco a fisiopatologia e o curso da doença. Nas manifestaçoes agudas da doença, sao tratados os sintomas. As crises dolorosas sao tratadas por hidrataçao, aquecimento e analgésicos, desde anti-inflamatórios nao esteroidais até opioides. A crise torácica aguda e seus sintomas sao tratados com inalaçao de O2, espirometria incentivada e transfusao sanguínea. No sequestro esplênico, a anemia severa ameaça a vida, assim, é necessária a transfusao sanguínea. O acidente vascular cerebral e infecçoes bacterianas seguem o tratamento padrao para qualquer indivíduo, contudo, os riscos de hemorragia devem ser bem avaliados e os glicocorticoides devem ser usados com cuidado. No caso de acidente vascular a transfusao sanguínea pode ser necessária.11

Nas manifestaçoes crônicas da doença sao também tratados os sintomas, decorrentes da hemólise e vaso-oclusao, contudo, medidas profiláticas devem ser utilizadas para minimizar a morbidade associada a cada condiçao. As medidas profiláticas incluem hidrataçao; o uso de penicilina (assim que o recém-nascido recebe o diagnóstico de HbSS); vacina conjugada meningogócica e vacina com polissacarídeo pneumocócico, além das demais vacinas recomendadas; transfusao sanguínea crônica e hidroxiureia para prevençao de acidente vascular cerebral. Entretanto, a transfusao sanguínea mensal pode trazer sequelas, sobretudo, no fígado e no coraçao, devido à sobrecarga de ferro.11

O único medicamento aprovado para o tratamento da anemia falciforme é a hidroxiureia (HU; hidroxicarbamida ou Hydrea®). A HU altera a enzima ribonucleotídeo redutase, resultando no atraso da fase S do ciclo celular e por mecanismo ainda nao esclarecido aumenta a produçao de HbF, mas, a resposta individual a HU é muito variável. Os indivíduos que respondem à HU apresentam melhoria das manifestaçoes clínicas da doença, com diminuiçao de 68 a 84% das crises em geral e a razao para o sucesso do tratamento, reside no aumento da HbF.4,12 Tendo em vista que a HbF nao forma polímero com a HbS, mesmo em alta concentraçao de HbS, o tratamento com HU reduz a falcizaçao e, portanto, a hemólise, a vaso-oclusao e os demais sintomas decorrentes desses eventos.4 Assim, diversos trabalhos buscando novos agentes que induzam a HbF ou moduladores alostéricos da HbS, que aumentem sua afinidade pelo O2 estao em curso, tendo em vista que a HU, pode levar à infertilidade, suscetibilidade à infecçao e apresenta efeitos mutagênico, carcinogênico e teratogênico.3,13

Alguns compostos fitoterápicos têm sido avaliados quanto ao efeito na anemia falciforme, mas no momento apenas duas preparaçoes tem a aprovaçao para testes clínicos. Estudo clínico de fase II revelou que o medicamento Niprisan (renomeado para Nicosan), composto por Piper guineense, Pterocapus osun, Eugenia caryophyllum e Sorghum bicolor, avaliado por 6 meses foi capaz de reduzir as crises dolorosas, sem causar efeitos adversos graves. O Ciklavit, composto por extrato etanólico da planta Cajanus cajan, aminoácidos essenciais, vitaminas e minerais também parece diminuir as crises dolorosas, mas nao apresenta resultados suficientes para alguma conclusao sobre sua eficácia na anemia falciforme.14,15

A única opçao curativa para a anemia falciforme é o transplante de células tronco hematopoéticas. Contudo, apenas 25% dos casos apresentam doadores compatíveis. Além disso, quando se comparam terapias celulares e nao celulares, nos últimos 20 anos, os resultados sao similares em termos de mortalidade pela anemia falciforme e, ainda, podem ocorrer sérias complicaçoes decorrentes da terapia celular, como a rejeiçao ao transplante e o risco de desenvolvimento de câncer. Outro ponto importante a se considerar sao eventos adversos pré-transplante, como a sobrecarga de ferro decorrente de transfusao sanguínea e as altas doses de químio e radioterapia antes do transplante. Assim, a utilizaçao de células mesenquimais para prevenir a rejeiçao e do sangue de cordao umbilical sao estratégias em estudo na anemia falciforme. Alguns aspectos ainda precisam ser mais bem explorados para o sucesso do transplante de células tronco hematopoéticas tais como: a fonte doadora, as doses de infusao celular e o protocolo para maximizar a eficácia da técnica.1,11,16

Outro alvo celular para o tratamento da anemia falciforme é a célula natural killer invariante T. Estas células estao aumentadas tanto em número como em ativaçao na anemia falciforme, contribuindo para a resposta inflamatória e quimiotaxia, induzindo a vaso-oclusao. Assim, testes estao em progresso para avaliar o efeito de bloqueadores e de anticorpos para diminuiçao dessas células.11

Nos últimos 30 anos foram realizados inúmeros estudos sobre terapia gênica para o tratamento da anemia falciforme. O longo caminho entre o desenvolvimento da terapia gênica e o uso clínico foi pavimentado pelos estudos e descobertas sobre a expressao e regulaçao dos genes do grupamento β globina e ainda sao necessários o desenvolvimento de estratégia eficiente para a transferência e a expressao duradoura do gene introduzido. Ensaios clínicos utilizando lentivírus como vetor do gene β globina humano funcional ou γ globina para sua introduçao nas células tronco hematopoéticas, sem a necessidade de terapia celular, estao em curso e têm se mostrado eficientes. O gene β globina utilizado apresenta mutaçao, que preserva as propriedades de ligaçao ao O2 e inibe a polimerizaçao da HbS. Híbridos β/γ e apenas γ têm sido estudados, tendo em vista que a HbF previne a polimerizaçao da HbS. Entretanto, a técnica requer quimioterapia ablativa da medula óssea e ainda o desenvolvimento de estratégia mais eficiente para a transferência e expressao duradoura do gene introduzido, além de nao estar descartado, o que o risco de transformaçao maligna (Figura 2).1,11,17,18

 


Figura 2. Terapia gênica na anemia falciforme. As célulastronco hematopoéticas CD34+ (CTH) sao coletadas do doador autólogo, após o que a medula sofre condicionamento quimio e/ou radioterápico para recepçao das CTH com o gene b globina funcional. O gene é introduzido por meio de vetor lentiviral (SIN DU3) contendo o gene b ou g funcional. Y, sinal de empacotamento; cPPT, polipurina central; HS, sítio hipersensível à DNase I; LCR, regiao controladora do lócus; LTR, repetiçoes terminais longas (U3, R e U5); RRE, elemento responsivo rev; WPRE, elemento regulador pós-transcricional do vírus Woodchuck da hepatite. Adaptado de Cottleet al.1 e Hoban et al.18

 

Nova abordagem molecular que busca a cura da anemia falciforme é a ediçao gênica. Com esta técnica, a regiao gênica com mutaçao é substituída pela sequência original, utilizando-se um conjunto de procedimentos, nos quais a nuclease atua em uma sequência específica do DNA, para alterá-la, seguido de síntese. As enzimas: nucleases dedo-de-zinco (ZFN), nucleases efetoras semelhantes a ativadores de transcriçao (TALENs), meganucleases e CRISPR (repetiçoes palindrômicas regularmente interespaçadas agrupadas) associada à nuclease Cas9 (CRISPR-Cas9) possuem moléculas programáveis ligantes de DNA, que permitem a introduçao de quebras da dupla fita de DNA em sítios específicos do genoma. A Cas9 utiliza RNA para guiar o reconhecimento da sequência-alvo. Após a clivagem do DNA, os mecanismos de reparo de quebra de dupla fita, inerentes às células eucarióticas, atuam na correçao do erro. Sao dois os mecanismos de reparo de quebra de dupla fita: a junçao de extremidades e a recombinaçao homóloga, sendo a habilidade para direcionar o tipo de reparo de relevância na terapia da anemia falciforme. Em princípio esta técnica utiliza intervençao ex vivo, depende da introduçao de nucleasse e do DNA molde para reparo, evitando a inserçao de DNA estrangeiro no genoma, que traz o risco de oncogênese, como os vetores virais. Cabe ressaltar ainda que a correçao direta do genoma tem a vantagem de preservar os mecanismos regulatórios endógenos do gene β globina, para que haja a produçao estequiométrica de cadeias globina durante a eritropoese (Figura 3).1,11,17-19

 


Figura 3. Ediçao gênica utilizando diferentes sistemas de nucleases (ZFN, TALEN, e CRISPR/Cas9). Cada sistema de nucleases identifica uma regiao específica do genoma por pareamento de nucleotídeos e cria a quebra da dupla fita do DNA. Na ausência do DNA molde ocorre reparo por junçao de extremidades, que resulta em knockout gênico. Na presença de DNA molde ocorre o reparo por recombinaçao homóloga, resultando na incorporaçao do segmento de DNA desejado (ediçao), com a correçao gênica. Cas9, nuclease associada à CRISPR (repetiçoes palindrômicas regularmente interespaçadas agrupadas); gRNA, RNA guia; QDF, quebra de dupla fita; RJE, reparo por junçao de extremidades; RRH, reparo por recombinaçao homóloga; TALEN, nuclease efetora semelhante a ativador de transcriçao; ZFN, nuclease dedode- zinco. Fonte: adaptado de Goodman e Malik.17

 

Uma vez estabelecida, a técnica de ediçao do genoma oferecerá potencial também para a ediçao de células do cordao umbilical do próprio indivíduo nascido com anemia falciforme, possibilitando a cura logo após o nascimento. Muito trabalho de pesquisa ainda será necessário para utilizaçao desta técnica in utero. É importante ressaltar que a ediçao do gene β globina em células embrionárias humanas pode levar a mutaçoes em alvos diferentes do desejado, podendo ser catastrófica, por isso necessita de cuidadosos testes pré-clínicos.11

Além da correçao gênica, a reativaçao da síntese da HbF tem sido estudada. O gene BCL11A codifica uma proteína repressora da expressao do gene γ globina, portanto, fundamental para a síntese da HbF. Esta proteína tem como alvo a regiao intergênica, LCR e sequências entre os genes HBG1 (gama 1) e HBD (delta), na célula eritroide, mas também é importante para outras células como os linfócitos B e células dendríticas, que participam do sistema imunológico. Assim, o knockout completo do gene BCL11A em células tronco hematopoéticas pode comprometer o sistema imunológico. Entretanto, a identificaçao de uma regiao intrônica, específica de células eritroides, potencializadora de BCL11A e a descoberta de variantes comuns com mutaçao nessa regiao que leva à síntese de HbF, mesmo no adulto, indicaram que a disrupçao dessa regiao acentuadora poderia diminuir a atividade de BCL11A e aumentar a síntese de HbF. Estudos demonstraram que a clivagem simples nessa regiao foi suficiente para induzir a síntese de HbF em modelos animais e cultura celular.1,17-19

Outra alternativa ao knockout de BCL11A seria a diminuiçao da expressao gênica utilizando RNA de interferência. Um novo vetor, RNA curto em grampo (shRNA), que utiliza a arquitetura de um miRNA, foi recentemente testado e demonstrou potente inibiçao da expressao do gene BCL11A em cultura de células precursoras de eritrócitos humanos. Nesse sistema, como ocorre na terapia gênica, o sucesso da estratégia depende da integraçao do vetor e da expressao sustentável deste.1,17,18

A possibilidade de construir fatores sintéticos que se ligam, especificamente, ao DNA indica a possibilidade da regulaçao de genes específicos. Assim, moléculas que alterem o dobramento da cromatina podem determinar a formaçao da alça da regiao LCR (regiao controladora do lócus) adequada para a expressao de γ globina, aumentando a síntese de HbF, como demonstrado em cultura de eritroblastos humanos de adultos. Contudo, esta estratégia dependerá da integraçao e expressao duradoura do vetor (Figura 4).1,18

 


Figura 4. Estratégias moleculares para o tratamento da anemia falciforme: ediçao gênica; induçao da síntese de hemoglobina fetal (HbF), por silenciamento gênico (RNA de interferência e disrupçao), dobramento da cromatina e terapia gênica. Fonte adaptado de Hoban et al.18

 

A medida que o conhecimento sobre a produçao de HbF aumenta, novos alvos moleculares poderao ser explorados. Assim, parece que algumas barreiras à terapia gênica foram transpostas, mas ainda há muitas outras e a natureza complexa da expressao e regulaçao dos genes β globina dificulta o processo. A segurança e eficácia dos protocolos de terapias moleculares só poderao ser estabelecidas a partir da realizaçao de cuidadosos testes clínicos e do acompanhamento dos indivíduos tratados. O rápido desenvolvimento de novas técnicas de engenharia genética oferecem perspectivas para novas abordagens moleculares para o tratamento e cura da anemia falciforme.1,18

 

CONCLUSAO

A anemia falciforme é a patologia monogênica mais comum e apesar de bem caracterizadas sua origem genética e bioquímica, os múltiplos efeitos fisiopatológicos da doença ainda nao sao bem esclarecidos. O único medicamento aprovado para o tratamento da anemia falciforme é o antineoplásico hidroxiureia e, apesar de seu sucesso terapêutico, nao é curativo, além de ser tóxico para o organismo. O único tratamento curativo disponível no momento é o transplante de células tronco hematopoéticas. Entretanto, o limitado número de doadores compatíveis impede sua ampla utilizaçao e mesmo no caso de compatibilidade pode ocorrer rejeiçao ao transplante.

A intensa pesquisa sobre o mecanismo molecular dos eventos fisiopatológicos da anemia falciforme tem permitido a busca por terapias celulares e moleculares curativas. A terapia gênica, em estudo há mais de 30 anos, parece agora oferecer alguma possibilidade real de tratamento, com vários estudos clínicos em curso. Contudo, além de cara alguns entraves para sua ampla utilizaçao precisam ser resolvidos, especialmente, a garantia da segurança da técnica. A ediçao gênica, a utilizaçao de RNA terapêutico e outras manipulaçoes genéticas para aumentar a síntese da HbF emergem como promissoras para o tratamento curativo da anemia falciforme.

 

AGRADECIMENTO

Ao PET-MEC-SESu pela bolsa à Cibele Marli Caçao Paiva Gouvêa.

 

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