RMMG - Revista Médica de Minas Gerais

Volume: 27 e1874 DOI: http://www.dx.doi.org/10.5935/2238-3182.20170068

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Artigo Original

Perfil de citocinas em recém-nascidos prematuros utilizando amostras de sangue coletadas em papel filtro: correlaçao com desfechos clínicos desfavoráveis

Cytokines in preterm newborns using blood samples collected on filter paper: correlation with unfavorable clinical outcomes

Juliana de Oliveira Marcatto1; José Augusto Almeida Barbosa2; Marcus Vinicius Andrade3; Camilla Ribeiro Lima Machado4; Ângela Soares da Cunha Castello Branco5; Luciana de Gouvêa Viana2; Pedro Guatimosin Vidigal2

1. Doutor, Enfermeira. Professora da Escola de Enfermagem da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)
2. Doutor, Médico
3. Doutor, Médico. Professor da Faculdade de Medicina (FM) da UFMG
4. Mestre em ciências aplicadas à saúde do adulto, Bióloga
5. Mestranda em saúde do adulto, Estatística

Endereço para correspondência

Juliana de Oliveira Marcatto
E-mail: julianaoliveiramarcatto@gmail.com

Recebido em: 01/05/2017.
Aprovado em: 09/08/2017.

Instituiçao: Escola de Enfermagem da Universidade Federal de Minas Gerais. Belo Horizonte, MG - Brasil.

Resumo

INTRODUÇAO: A identificaçao precoce de citocinas pode favorecer a conduçao clínica e adoçao de medidas preventivas na populaçao neonatal.
OBJETIVO: Avaliar os níveis séricos de Interleucinas (IL) 2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, Interferon gama (IFN-γ), Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-α) e Fator Estimulador de Colônias de Granulócitos e Mastócitos (GM-CSF) nas primeiras três horas de vida de recém-nascidos prematuros através de coleta de sangue em papel filtro.
MÉTODOS: Estudo analítico observacional prospectivo desenvolvido com 34 recém-nascidos prematuros com idade gestacional entre 28 e 32 semanas. As dosagens foram feitas com 10, 60 e 180 minutos de vida em papel filtro. Utilizado o reagente Bio-Plex ProT Human Cytokine Standard 8 plex, Group I BIO-RAD e as leituras realizadas com Luminex 100.
RESULTADOS: Houve associaçao entre sepse e a presença de IFN-γ e TNF-α com 10, 60 e 180 minutos de vida. A associaçao entre sepse e a presença de IL-6 foi observada com 180 minutos de vida. Níveis reduzidos de GM-CSF na primeira hora de vida foram relacionados à hipotermia (p=0,005) à admissao na unidade neonatal.
CONCLUSAO: A detecçao dos níveis de citocinas em papel filtro é viável nas primeiras horas de vida de recém-nascidos prematuros. As vantagens sao a facilidade de coleta, armazenamento, transporte e utilizaçao de pequenos volumes. O IFN-γ e TNF-α e IL-6 podem ser considerados marcadores para o desenvolvimento de sepse nessa populaçao. A reduçao dos níveis de GM-CSF em pacientes hipotérmicos favorecendo quadros de neutropenia aponta para a importância da prevençao da hipotermia.

Palavras-chave: Citocinas; Testes Hematológicos; Recém-Nascido Prematuro; Sepse.

 

INTRODUÇAO

Em recém-nascidos prematuros, várias intervençoes sao necessárias para fornecer suporte de vida e auxiliar no processo de adaptaçao à vida extrauterina.1 Suporte ventilatório, hemodinâmico e metabólico sao frequentemente necessários desde o momento do nascimento em sala de parto e se estendem para a unidade neonatal durante as primeiras horas de vida. Tais intervençoes sao potencialmente estressoras e capazes de induzir a liberaçao de citocinas que atuam como mediadores da resposta inflamatória, sendo responsáveis por induzir quimiotaxia para o local da lesao.2,3

Investigaçoes acerca dos níveis séricos de citocinas e a associaçao com os desfechos clínicos desfavoráveis prevalentes em recém-nascidos prematuros têm sido conduzidas com o objetivo de favorecer diagnósticos precoces, aumentar a sobrevida, minimizar morbidade e mortalidade, além de possibilitar a adoçao de medidas preventivas e mudanças nas práticas assistenciais vigentes.4-7

A utilizaçao de soro e plasma é o padrao ouro na identificaçao de biomarcadores. Entretanto, o custo, a logística relacionada à punçao venosa ou arterial, a manipulaçao e transporte das amostras após a coleta configuram obstáculos para essa prática.7,8 Na populaçao neonatal, além de todas estas consideraçoes, o volume de sangue utilizado na realizaçao dos exames deve ser um ponto de atençao, uma vez que múltiplas coletas resultam em comprometimento da volemia total, aumentando o risco de anemia e de quadros clínicos específicos da prematuridade, tais como desequilíbrios hidroeletrolíticos, apneia e alteraçoes do fluxo sanguíneo cerebral.9

A utilizaçao de dosagens a partir de sangue coletado em papel filtro é um recurso alternativo por apresentar uma série de vantagens. Trata-se de um procedimento minimamente invasivo que pode ser realizado através de punçao de calcanhar, sem a necessidade de processamento da amostra. Além disso, o armazenamento e transporte das amostras é fácil e tem como principal benefício o fato de utilizar pequenos volumes de sangue e promover estabilizaçao dos mediadores a serem investigados, especialmente no caso das citocinas.10

O objetivo desse estudo foi avaliar o perfil das citocinas interleucina (IL) 2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, Interferon gama (IFN-γ), Fator de Necrose Tumoral (TNF-α) e Fator Estimulador de Colônias de Granulócitos e Mastócitos (GM-CSF) nas primeiras três horas de vida de recém-nascidos prematuros com idade gestacional entre 28 e 32 semanas, através de coleta de sangue em papel filtro correlacionando-os com desfechos clínicos desfavoráveis do período neonatal. Objetivou-se ainda avaliar a associaçao dos níveis dessas ocitocinas com o desenvolvimento de hipotermia. A investigaçao do comportamento das citocinas nessa populaçao em estágios de vida tao precoce pode ajudar na adoçao de medidas preventivas e de controle uma vez que a maior parte das investigaçoes realizadas em recém-nascidos ocorreu a partir de quatro horas de vida.11

 

MÉTODOS

Trata-se de um estudo analítico observacional prospectivo realizado em um hospital de Belo Horizonte, MG. Os pacientes foram recrutados no período de julho/2013 a dezembro/2014, sendo incluídos prospectivamente 34 recém-nascidos prematuros com idade gestacional entre 28 a 32 semanas, nas primeiras três horas de vida. O estudo foi aprovado pelos Comitês de Ética da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG) e da Instituiçao hospitalar onde foi realizada a coleta de dados. Os responsáveis pelos recém-nascidos envolvidos na pesquisa assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.

Os critérios de exclusao foram recém-nascidos portadores de malformaçoes congênitas, filhos de maes diabéticas e/ou submetidas à anestesia geral para o parto, usuárias de drogas ilícitas ou portadoras de síndromes que cursam com doenças endócrinas, além de recém-nascidos em parada cardiorrespiratória ao nascimento. Os pacientes envolvidos nesse estudo foram acompanhados até a alta ou óbito hospitalar a fim de se avaliar os desfechos clínicos estudados.

As amostras de sangue capilar foram coletadas em papel filtro em três momentos distintos: 10, 60 e 180 minutos de vida através de punçao de calcanhar. A técnica utilizada para realizaçao das punçoes seguiu as orientaçoes adotadas pelo Núcleo de Pesquisa em Apoio Diagnóstico da Faculdade de Medicina da UFMG (NUPAD) descrito no programa de triagem neonatal, seguindo as recomendaçoes do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), Procedures and Devices for the Collection for Diagnosis Capilary Blood Specimens; Approves standard - Sixth Edition, CSLI document H04-A6 (ISBN1-56328-667-8).

Para cada tempo foram preenchidos cinco círculos (spots) do papel filtro, mantido na posiçao horizontal por três horas para secagem, identificado e posteriormente congelado a 20°C negativos até a análise. O eluato foi obtido a partir de metodologia testada previamente como componente deste trabalho (9 mm de papel filtro eluído com 250 µL de soluçao tampao).12 O presente estudo recebeu financiamento da Fundaçao de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), processo nº APQ-00863-11, demanda universal.

Todas as dosagens foram realizadas em duplicata. As dosagens de IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-γ, TNF-α e GM-CSF foram realizadas usando o reagente comercialmente disponível Bio-Plex ProT Human Cytokine Standard 8 plex, Group I BIO-RAD, Richmond, CA, USA. Trata-se de um ensaio que utiliza a metodologia xMAP, possibilitando a determinaçao quantitativa de múltiplas citocinas que apresenta precisao intra e interensaio de 5 a 10% para citocinas. As leituras foram analisadas através de um sistema automatizado de análises laboratoriais (Luminex 100; Luminex, Austin, TX, USA) com software adequado.

As variáveis explicativas estudadas foram idade gestacional, peso de nascimento, gênero, Apgar de primeiro e quinto minuto, temperatura axilar à admissao na unidade neonatal, tipo de parto, uso de corticoide pré-natal, fraçao inspirada de oxigênio (FiO2) máxima, tempo de utilizaçao de Pressao Positiva Contínua em Vias Aéreas (CPAP), tempo de utilizaçao de ventilaçao mecânica, uso de aminas, hemotransfusao e tempo total de internaçao. Dentre as variáveis desfecho, foi investigada a correlaçao entre a dosagem das citocinas e a displasia broncopulmonar (DBP), sepse, hemorragia peri-intraventricular (HPIV), retinopatia da prematuridade (ROP) e óbito.

Análise estatística

Foi realizada a caracterizaçao da amostra total, com análise da frequência para as variáveis categóricas e as medidas descritivas (média, mediana, percentis 25 e 75, mínimo, máximo e desvio-padrao) para as variáveis quantitativas. O teste de Kolmogorov-Smirnov foi utilizado para testar a normalidade dos dados. Como a dosagem das citocinas IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-γ e TNF-α mostrou uma distribuiçao nao normal, testes nao paramétricos foram utilizados.

Testes paramétricos foram utilizados para GM-CSF, por apresentar distribuiçao normal nos dados. Para a comparaçao das dosagens das citocinas (IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-γ e TNF-α) em relaçao aos tempos avaliados, usou-se o teste de Friedman e o teste ANOVA de medidas repetidas para GM-CSF. As comparaçoes múltiplas (dois a dois) quando necessárias foram realizadas pelo teste de Wicoxon.

Para avaliaçao da expressao das citocinas em cada tempo por desfecho (sepse, DBP ROP, HPIV, óbito e sem desfecho desfavorável) empregou-se o teste de Mann-Whitney para IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-γ e TNF-α e o teste t de Student para GM-CSF. Análise univariada foi realizada para avaliar associaçao entre desfechos clínicos como sepse e a presença de citocinas nos diferentes tempos de coleta utilizando-se para tal o teste Qui-quadrado de Pearson com correçao de Yates ou Teste exato de Fisher quando adequado, calculando-se entao o OR e IC 95%. Em todos os testes estatísticos o nível de significância utilizado foi de 5%, ou seja, testes com valor p inferior a 5% foram considerados significativos. Todas as análises foram realizadas com o software SPSS versao 20.0 salvo a análise univariada quando foi utilizado o software Minitab 16.

 

RESULTADOS

Os dados demográficos, perinatais e neonatais dos 34 recém-nascidos incluídos no estudo estao descritos na Tabela 1 e a frequência de desfechos clínicos está descrita na Tabela 2. Todos os pacientes da pesquisa utilizaram CPAP em sala de parto, durante transferência e nas três primeiras horas de admissao na unidade neonatal. A FiO2 variou de 40 a 100%, 91,2% das maes nao apresentaram infecçao do trato urinário (ITU) durante a gestaçao. Nenhum dos pacientes incluídos na pesquisa foi intubado nas primeiras três horas de vida, mas alguns foram intubados posteriormente, sendo a média de utilizaçao de ventilaçao mecânica de 12,6 dias nesta populaçao.

 

 

 

 

Foi evidenciada diferença estatisticamente significativa entre os tempos para as citocinas IL-6, IL-8 e IFN-γ (p<0,05). As citocinas IL-2 e IL-4 nao foram detectadas em nenhum dos tempos investigados.

Comparando-se a expressao de citocinas nos diferentes tempos estudados em relaçao a cada desfecho (sepse, DBP, ROP, HPV e óbito), o único achado significativo estatisticamente foi para o grupo que desenvolveu sepse. Nesse grupo a expressao do TNF-α com 60 minutos de vida foi maior que no grupo sem sepse (Tabela 3). Nao houve diferença para outras citocinas, em diferentes tempos e para os demais desfechos.

 

 

Uma vez identificada essa diferença na variável sepse, teste de correlaçao (analise univariada) foi aplicado buscando-se identificar outras associaçoes entre as citocinas e os demais desfechos propostos no estudo. Foi encontrada correlaçao da expressao de citocinas apenas para o desfecho sepse. Assim, houve associaçao significativa entre sepse e a presença de IFN-γ e TNF-α com 10, 60 e 180 minutos de vida (p<0,05). A associaçao significativa entre sepse e a presença de IL-6 foi observada com 180 minutos de vida (p<0,05) (Tabela 4).

 

 

Na populaçao estudada, 13 pacientes apresentaram temperatura axilar inferior a 36,4°C no momento da admissao na unidade neonatal. Quando avaliados os níveis séricos de citocinas na populaçao que desenvolveu hipotermia comparando com os recém-nascidos que nao desenvolveram, observou-se que os valores de GM-CSF foram significativamente mais elevados no grupo que nao apresentou hipotermia (p=0,005) (Tabela 5).

 

 

Quando o grupo que nao demandou intubaçao durante a internaçao (16 pacientes) foi comparado ao grupo intubado após a terceira hora de vida (18 pacientes), nao foram evidenciadas diferenças estatisticamente significativas nas dosagens das citocinas investigadas nas primeiras três horas de vida.

A populaçao foi estratificada de acordo com o peso de nascimento e dividida em dois grupos: maiores (13 pacientes) e menores de 1500 gramas (21 pacientes), nao sendo identificadas dosagens de citocinas com diferença estatisticamente significativa entre os grupos nos diferentes tempos estudados.

 

DISCUSSAO

A avaliaçao e detecçao das citocinas nos primeiros 180 minutos de vida, em recém-nascidos prematuros, em papel filtro, conforme se mostrou possível nesse estudo, revelam perfis complexos que podem ser de significância fisiológica e patofisiológica servindo como possíveis marcadores de desfechos graves que acometem essa populaçao.

A utilizaçao do papel filtro como estratégia para realizaçao de monitoramento laboratorial tem sido testada nos últimos anos.10,13,14 A principal vantagem da coleta de amostras de sangue em papel filtro é o pequeno volume necessário, o que na populaçao neonatal constitui aspecto relevante em decorrência da volemia total circulante e da grande demanda de múltiplas coletas para monitoramento clínico e laboratorial.

A menor intensidade da dor causada aos recém-nascidos, a facilidade de coleta, armazenamento, transporte e a estabilidade das citocinas sao também vantagens da utilizaçao do papel filtro quando comparada à coleta convencional.8,13,14 A coleta utilizando-se esse método se mostrou exequível e tecnicamente simples por meio desse trabalho.

A dosagem de biomarcadores com potencial preditivo e/ou prognóstico tem sido alvo de vários estudos em neonatologia, uma vez que pode possibilitar a identificaçao de grupos de pacientes com maior probabilidade de desenvolvimento de desfechos clínicos graves ou com potencial de complicaçao, o que possibilita a identificaçao precoce e a adoçao de medidas preventivas direcionadas para este grupo.11,15

Em relaçao ao comportamento das citocinas nos diferentes tempos, observou-se diferença estatisticamente significativa entre os tempos avaliados na expressao de IL-6, IL-8 e IFN-γ. Existem divergências na literatura acerca do momento de liberaçao das citocinas. IL-6 apresentou concentraçoes diferenciadas nos três tempos, sendo as maiores concentraçoes detectadas com 60 minutos de vida. Em relaçao à IL-8, níveis progressivamente mais elevados foram observados ao longo das três primeiras horas de vida. IL-6 e IL-8 apresentam meia-vida curta e suas concentraçoes circulantes reduzem significativamente com o tratamento antimicrobiano nos casos de sepse, tornando-as indetectáveis após 24 horas de instituiçao do tratamento.16

Wu et al.17 conduziram um estudo com 75 recém-nascidos com diagnóstico de sepse e concluíram que altos níveis de IL-6 e IL-8 estavam correlacionados à gravidade da infecçao e que a detecçao dessas duas citocinas de maneira combinada pode auxiliar no diagnóstico de sepse. Entretanto, a observaçao do comportamento das mesmas pode ser útil na identificaçao de práticas que induzem resposta inflamatória, ainda que nao descritas como doenças com fisiopatologia estabelecida, como acontece nos casos de manipulaçoes e procedimentos realizados na prática clínica, incluindo os potencialmente dolorosos e que muitas vezes sao considerados pela equipe como sendo intervençoes isentas de riscos.

Mesmo em relaçao à sepse, como as dosagens podem ser feitas nas primeiras três horas de vida, sua presença poderia, sim, já chamar a atençao para o desenvolvimento desse desfecho (no caso da IL-6), no que pese a possibilidade do uso de antimicrobianos maternos no periparto interferir negativamente nos níveis dessas dosagens, o que nao foi motivo de abordagem no presente estudo. Especificamente quanto ao IFN-γ, o mesmo foi detectado com três horas de vida. Em trabalhos que investigam a associaçao de citocinas com DBP, o IFN-γ apresentou correlaçao com DBP e óbito.11

Em relaçao à sepse, foi evidenciada a correlaçao de IL-6, IFN-γ e TNF-α nos primeiros 180 minutos de vida, nao sendo identificado o mesmo para DBP, ROP, HPIV e óbito.

A sepse é uma das maiores causas de morbidade e mortalidade nas unidades neonatais, sendo sua identificaçao, prevençao e controle um grande desafio para a equipe de saúde.18,19 Um estudo demonstrou que o TNF-α apresenta alta sensibilidade no diagnóstico de inflamaçao, mas nao pode ser utilizado para diferenciar recém-nascidos infectados de nao infectados e que níveis aumentados podem predizer maior risco de óbito. Assim, os autores desse estudo sugerem a associaçao de dosagem de IL-6 e TNF-α para diagnóstico de sepse neonatal.18

Outros estudos também demonstraram o aumento dos níveis de TNF-α em pacientes com sepse clínica quando comparados ao grupo controle.20,21 A expressao de TNF-α parece ter correlaçao com a gravidade da sepse e com a mortalidade.22 A maioria dos trabalhos publicados investigaram recém-nascidos de muito baixo peso buscando a associaçao da expressao de citocinas com os desfechos clínicos de etiologia inflamatória prevalentes no período neonatal, especialmente de DBP e sepse.11,23,24

No presente estudo 17,6% da populaçao estudada desenvolveu displasia broncopulmonar, mas nao foi evidenciada correlaçao com as citocinas investigadas em nenhum dos tempos estabelecidos. A relaçao das citocinas com o desenvolvimento de retinopatia da prematuridade e hemorragia intraventricular também foi investigada em alguns estudos, mas assim como para DBP também nao foi demonstrada no presente estudo.6,25,26

Na populaçao estudada, um dos nove pacientes com diagnóstico de retinopatia da prematuridade desenvolveu a forma grave da doença, nao havendo nenhum caso de hemorragia peri intraventricular grau III e IV. Porém, vale ressaltar que a intensidade da resposta de expressao das citocinas (resposta inflamatória), está associada com a intensidade do dano. Como no presente estudo praticamente os pacientes nao apresentaram formas graves das doenças (DBP e ROP), essa pode ser uma explicaçao para o achado da correlaçao das citocinas apenas com sepse.

As dosagens de GM-CSF nao apresentaram diferenças estatisticamente significativas entre os tempos analisados. Entretanto, chamou a atençao o fato de que na populaçao estudada foi identificada correlaçao entre a reduçao dos níveis séricos de GM-CSF em 13 pacientes que apresentaram hipotermia (temperatura axilar inferior a 36,4°C) à admissao na Unidade Neonatal quando comparada à populaçao que nao apresentou hipotermia.

O GM-CSF tem como característica estimular a proliferaçao de células progenitoras mieloides -unidades formadoras de colônias de granulócitos macrófagos (CFU-GM) e unidades formadoras de colônias de eosinófilos (CFU-EO), induzindo também a maturaçao e liberaçao para o sangue periférico do pool de neutrófilos medulares. Ambos os fatores, além da açao exercida na medula óssea, agem também nos neutrófilos maduros, melhorando sua funçao, ou seja, aumentando a quimiotaxia, a fagocitose, a atividade bactericida e o metabolismo oxidativo, em estudos experimentais in vitro em neutrófilos de recém-nascidos.

O desenvolvimento de neutropenia é uma condiçao frequente entre recém-nascidos prematuros e, por este motivo, a administraçao de GM-CSF tem sido proposta como estratégia profilática e terapêutica nos casos de sepse. Entretanto, os dados disponíveis na literatura nao subsidiam sua utilizaçao.27,28 Ficou demonstrado no presente estudo que a hipotermia reduz os níveis de GM-CSF sugerindo a possibilidade de quadros mais severos de neutropenia e, consequentemente, maior probabilidade de desenvolvimento de quadros sépticos.

Alguns pacientes incluídos na pesquisa, apesar de nao terem sido intubados nas primeiras três horas de vida, demandaram intubaçao posterior durante a internaçao (18 pacientes). Foi investigado se esta populaçao apresentava comportamento diferenciado em relaçao aos níveis séricos de citocinas quando comparada à populaçao que nao demandou ventilaçao mecânica em nenhum momento durante a internaçao (16 pacientes), nao sendo identificadas diferenças estatisticamente significativas entre estas populaçoes.

A estratificaçao da populaçao estudada de acordo com o peso se mostrou necessária, uma vez que a maior parte dos estudos desenvolvidos em relaçao às dosagens de citocinas e sua correlaçao com os desfechos clínicos sao realizados em populaçoes de recém-nascidos de extremo baixo peso. Assim, foi comparada a relaçao com os desfechos clínicos entre menores e maiores de 1500 gramas, nao sendo identificadas diferenças de comportamento entre as populaçoes de nenhuma das citocinas investigadas.

 

CONCLUSAO

A descriçao do comportamento das citocinas em estágios precoces de vida pós-natal pode possibilitar avaliaçoes em relaçao ao potencial estressor dos procedimentos realizados nas primeiras horas de vida. Esta expressao demonstra a capacidade fisiológica de recém-nascidos prematuros de responder a insultos, que podem ter início na vida intrauterina, sendo potencializados pelos procedimentos pós-natais aos quais sao submetidos especialmente nas primeiras horas de vida.

A correlaçao de sepse neonatal e dosagens elevadas de IL-6, IFN-γ e TNF-α representa achado promissor no monitoramento de recém-nascidos sob o risco de tal desfecho. A hipotermia resulta em reduçao dos níveis de GM-CSF favorecendo quadros de neutropenia, o que aponta para a necessidade de cuidados voltados para prevençao desse quadro, especialmente no que se refere à manipulaçao de recém-nascidos prematuros nas primeiras horas de vida.

 

AGRADECIMENTOS

Nós gostaríamos de agradecer às famílias que autorizaram a inclusao de seus bebês nesse trabalho e à Fundaçao de Amparo à Pesquisa do Estado de \Minas Gerais (FAPEMIG) pelo apoio financeiro para desenvolvimento da pesquisa (demanda universal, processo nº APQ00863-11.

 

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